Consiglio Nazionale delle Ricerche

Progetto Finalizzato Invecchiamento

Responsabile U.O.: SANTONI Angela

Qualifica Responsabile scientifico: Professore ordinario o straordinario
Tipo di Ente: Università
Sede della ricerca: Università "La Sapienza" - Dipartimento di Medicina Sperimentale e Patologia - Roma
V.le Regina Elena, 324 - 00161 - Roma
tel.: 06-4468448 - fax: 06-4468448

Dati scientifici

sottoprogetto	1	Gerontobiologia
linea	1.4	Sistema immunologico
obiettivo	1.4.1	Valutazione dell'involuzione età-dipendente del timo, con particolare riguardo alla funzione endocrina. Verifica della dipendenza del processo evolutivo da fattori costituzionali, genetici e/o microambientali di natura neuroendocrina e nutrizionale.

Tema della ricerca

Differenziamento timico: ruolo di proteine della matrice extracellulare, citochine ed ormoni steroidei durante l'invecchiamento.

Parole chiave
Timo	Molecole d'adesione	Cellule stromali	Acido arachidonico
Thymus	Adhesion molecules	Stromal cells	Arachidonic acid

Stato dell'arte

Il timo è un organo linfoepiteliale che nell'uomo raggiunge il suo massimo sviluppo nella pubertà. Successivamente si assiste ad un' involuzione che porta ad una sua notevole riduzione, quest'ultimo evento è considerato come un processo di invecchiamento caratterizzato da una ridotta capacità di produrre le cellule T immunocompetenti. Il progenitore linfoide presente nel midollo osseo migra nel timo e qui, in seguito a processi di proliferazione, differenziazione, maturazione, originano i linfociti T maturi che migrano nel sangue e negli organi linfoidi periferici per svolgere il ruolo di difesa nei confronti dei diversi antigeni estranei. lI timo rappresenta quindi la sede di complessi eventi atti a modellare il repertorio dei linfocitiT e tale da generare cellule in grado di rispondere solo a ciò che è estraneo preservando invece ciò che è autologo. L'ambiente timico dove avviene la maturazione e differenziazione dei timociti è rappresentato da una componente stromale costituita sia da una rete di proteine della matrice extracellulare che da cellule non linfoidi come le cellule epiteliali, le cellule dendritiche interdigitate e macrofagi di origine midollare. Nel corso della maturazione timica avvengono una serie di riarrangiamenti casuali nei geni del TCR ( T cell receptor) di ciascun timocita che conducono alla generazione della diversa specifità antigenica dei TCR. In seguito all'espressione del recettore per l'antigene, i timociti sono sottoposti a processi di selezione sia positiva che negativa mediante i quali solo i timociti che riconoscono con affinità intermedia i peptidi antigenici nel contesto di molecole MHC autologhe espresse dalle cellule stromali lasciano il timo , mentre quelli che legano ad alta affinità l'MHC self o peptidi autologhi associati all'MHC self vengono eliminati . In seguito a questi processi di selezione solo il 5% dei timociti migra in periferia mentre circa il 95% dei timociti muore per apoptosi all'interno del timo stesso. Esperimenti condotti nel topo hanno dimostrato che i glucocorticoidi endogeni hanno un ruolo nell'indurre fisiologicamente l'apoptosi dei timociti. Anche nell'uomo si è dimostrato che i timociti in vitro sono sensibili all'azione dei glucocorticoidi e vanno incontro ad apoptosi. Tra gli altri ormoni steroidei, gli estrogeni hanno dimostrato avere un forte effetto timolitico e la sensibilità a tali effetti dipende dal ciclo cellulare, infatti la fase S risulta essere più critica. Nel timo i diversi stadi di maturazione delle cellule risultano avere una diversa sensibilità all'effetto degli ormoni steroidei. L'idrocortisone ha un effetto timolitico sulle cellule corticali CD4+CD8+, gli estrogeni invece agiscono su una popolazione di timociti immaturi con una risultante compromissione della differenziazione.
Tra i fattori solubili che influenzano la maturazione timica troviamo le citochine prodotte sia dalle cellule stromali come IL-7 o IL-6 ma anche dai timociti stessi come l'IL-2 e IL-4.
Un ruolo importante nella proliferazione e differenziazione dei linfociti T nel timo emerso da recenti studi, è quello della matrice extracellulare (ECM) . L'azione della ECM è mediata da recettori integrinici costituiti dall'associazione di una catena alfa ed una beta espressi dai timociti. Nel topo, infatti, i timociti immaturi CD4-CD8- aderiscono costitutivamente alla fibronectina o alle cellule stromali e tale adesione correla con l'elevata espressione del VLA-4 (recettore alfa-4/beta-1 per la fibronectina e per il VCAM-1). L'adesione alla fibronectina definisce uno stadio di sviluppo dei timociti meno maturi nella fattispecie CD4+CD8+, rispetto a quello dei timociti maturi che non aderiscono alla FN ed hanno un'alta efficienza di migrazione. L'alfa-6/beta-4 funziona come recettore integrinico per la laminina ed è espresso dai timociti murini fetali. Nella vita postnatale si assiste alla graduale scomparsa dell'espressione della catena beta-4 con probabile sostituzione con la catena beta-1. Altre molecole di adesione coinvolte nell'interazione tra i timociti e le cellue epiteliali sono il CD2 o l'LFA-1 recettori rispettivamente per l'LFA-3 e ICAM-1. La funzione dei recettori per la ECM non è solo quella di mediare l'adesione dei timociti ma anche un ruolo costimolatorio nella trasduzione del segnale a partire dal CD3 che si traduce in un aumento della proliferazione e produzione di citochine come l'IL-2.
Una condizione in cui viene osservata una involuzione timica è quella riscontrata durante la crescita tumorale del tumore 3LL "Lewis Lung Carcinoma" nei topi. Questa condizione potrebbe essere implicata nella immunosoppressione generalizzata che si osserva in soggetti affetti da tumore. In particolare, in quest'ultimi si osserva una marcata diminuzione della capacità del sistema immunitario di rispondere alla stimolazione antigenica e inoltre un eccesso di sintesi e di rilascio degli eicosanoidi , metaboliti dell'acido arachidonico.

Obiettivi

Analisi degli effetti funzionali e molecolari secondari all'interazione dei timociti con proteine della matrice extracellulare, cellule stromali timiche, citochine, metaboliti dell'acido arachidonico nel corso dell'invecchiamento.

Attività

L'attività di ricerca durante il periodo di durata del PFI si è rivolta alla comprensione dell'invecchiamento immunitario. A tal fine sono stati affrontati vari aspetti che riguardano l'involuzione timica che procede col procedere dell'età e che viene considerata come un processo fisiologico d'invecchiamento. I timociti durante la loro differenziazione interagiscono con cellule e fattori di natura diversa sia di provenienza strettamente timica che provenienti dal circolo periferico. Sono state studiate le proteine della matrice extracellulare e i loro recettori integrinici per comprendere se i timociti che si stanno sviluppando ricevano segnali differenziativi dall'ambiente timico. Sono state allestite colture primarie di cellule stromali timiche murine , successivamente stabilizzate e utilizzate per studiare la differenziazione dei precursori timici. I topi portatori del tumore 3LL sono stati il modello sperimentale per studiare l'effetto dei metaboliti dell'acido arachidonico sul timo.

Risultati

I risultati ottenuti dallo studio del ruolo della matrice extracellulare nel differenziamento timico nell'uomo indicano che esiste una correlazione tra l'espresione delle integrine beta-1(VLA-1/6) e quella dei rispettivi ligandi. Sono VLA-2+ VLA-3+ e VLA-6+ le cellule epiteliali capsulari che fronteggiano la membrana basale ricca in fibronectina, laminina e collageno. I timociti immaturi esprimono alti livelli di VLA-4 mentre i macrofagi corticali sono positivi per VCAM-1, ligando del VLA-4 oltre che per la fibronectina. I timociti midollari dal fenotipo CD3 "bright" esprimono sia VLA-4 che VLA-6 recettore per la laminina. Un'analisi delle sottopopolazioni timocitarie ha mostrato come l'espressione dei recettori per la fibronectina il VLA-4 e il VLA-5 non cambia durante la maturazione ma lo stato di attivazione costitutivo di queste integrine decresce dalla popolazione più immatura a quella più matura. Ciò è in accordo con dati recenti che riportano che i timociti umani immaturi sono caratterizzati da ferma adesione mentre l'interazione di quelli più maturi con la fibronectina induce in essi non adesione ma migrazione, suggerendo l'esistenza di stati funzionali diversi dei recettori integrinici a seconda dello stadio maturativo.
Per quanto riguarda lo studio della differenziazione timica , il ruolo dell'interazione con le cellule stromali in questo prrocesso si è dimostrato di fondamentale importanza. E' stata infatti tecnologicamente innovativa la stabilizzazione di una linea di cellule epiteliali timiche dal topo. Questa linea è capace di sostenere la differenziazione di timociti murini immaturi che vengono coltivati in presenza di essa. Fenotipicamente queste cellule presentano marcatori caratteristici delle cellule neuronali come i neurofilamenti e sono in grado di produrre IL-6 che rappresenta sia un fattore neurotrofico necessario quindi per la loro crescita autocrina , sia un fattore implicato nella differenziazione dei timociti. Ulteriori dati a favore della derivazione neuronale delle cellule che popolano lo stroma timico derivano dal fatto che l'Epidermal Growth Factor ( EGF) promuove l'espressione di marcatori neuronali e un aumento di cellule che esprimono i geni che codificano per il CNTF (Ciliary Neurotrophic Factor) e per il neuropeptide preprotachichinina-A, marcatori anche'essi delle cellule neuronali. Le cellule epiteliali così stabilizzate producono fibronectina e l'adesione dei timociti CD4-CD8- a questa proteina della ECM è mediata dall'espressione del VLA-4. L'acido retinoico che controlla la differenziazione di vari tipi cellulari, inibisce la produzione di fibronectina e compromette la maturazione in vitro dei timociti.
Durante la crescita di un tumore i timociti dell'ospite vanno incontro a modificazioni che conferiscono loro capacità immunosoppressive. I dati indicano che la grande quantità di metaboliti dell'acido arachidonico come PGE2, LTB4 e LTC4 prodotti nei topi portatori del tumore 3LL "Lewis Lung Carcinoma" contribuisce a questa attività immunosoppressiva in quanto il blocco del metabolismo dell'acido arachidonico diminuisce fortemente tale attività . Un'analisi più dettagliata delle modificazioni a cui va incontro il timo degli animali portatori di tumore ha rivelato che l'organo subisce un processo d'involuzione con decremento del numero totale dei timociti e una diminuzione delle cellule CD4+CD8+ e un aumento delle CD4-CD8- e delle sottopopolazioni singole positive. Questa involuzione ha una correlazione diretta con l'aumento di dimensioni del tumore e della formazione di metastasi. Poichè questo quadro è paragonabile a quello che si ottiene durante il trattamento con steroidi, sono stati misurati, nei topi portatori di tumore, i livelli plasmatici di corticosterone che risultavano particolarmente elevati, indicando che ciò potrebbe essere implicato nella immunosoppressione osservata nei soggetti affetti da tumori.